外泌體分離試劑盒（SEC法）

產品描述

本試劑盒基于分子排阻色譜原理（SEC法），通過分子大小差異實現(xiàn)外泌體分離，具有操作簡便、高純度和高回收率的優(yōu)點，特別適用于大體積樣本的外泌體分離。分離的外泌體可用于 WB 分析、NTA 或納米流式粒徑分析、電鏡檢測、組學研究及細胞和動物實驗中的功能研究。本試劑盒常用于細胞培養(yǎng)上清、尿液等大體積樣本，也適用于血清、血漿等樣本。

訂購信息

產品組分

運輸與保存

常溫運輸。組分A在4℃保存，組分B常溫保存，有效期12個月。

使用方法

自備儀器、試劑與耗材：高速冷凍離心機、離心管、超濾管（MWCO：50 kDa）、PBS（現(xiàn)配現(xiàn)用，0.2um 過濾，超聲或真空脫氣）、20%乙醇（現(xiàn)配現(xiàn)用，0.2um 過濾，超聲或真空脫氣）、純化柱固定器(自行購買或者合適的固定試管鐵架臺，以避免操作過程中發(fā)生晃動)

1.      樣品預處理

(1）            去除細胞：將樣品在 4℃、300g 離心 5 min，轉移上清至新離心管；無細胞樣本可跳過此步驟。

(2）            去除細胞及碎片：4℃、2,000g 離心 10 min，轉移上清至新離心管。

(3）            去除大體積顆粒：步驟 (2)得到的上清，在 4℃、14,000g 下離心 30 min，轉移上清至新離心管。

2.      純化柱預處理

(1)     將外泌體純化柱（Exosome Purification Column(10mL)）安裝在純化柱固定器上，下方放置廢液槽。讓純化柱在室溫（18-25℃）平衡至少 30 min；溫度過低或過高會影響分離效果。

(2)     檢查純化柱下端是否充滿液體，如無空氣可跳過此步驟；若有空氣，將純化柱倒置，打開下端密封帽，用移液器或注射器注入水或 20% 乙醇頂出空氣，使密封帽中充滿液體后重新蓋上，并放回固定器。

(3)     打開純化柱頂蓋，再打開下端密封帽，棄去封柱液（可倒掉或用移液器吸出），將純化柱適配器（Column Adapter (10 mL)）連接到純化柱，從頂部加入 2 倍柱體積（20 mL）PBS 進行平衡，至下端無溶液流出。清洗過程中確保頂部篩板始終保持濕潤。完成后，蓋上底端密封帽，斷開適配器，并加入 1 mL PBS 備用。

注：

①      每次操作前應先打開純化柱上蓋，再打開下端密封帽，以避免空氣進入，影響分離效果。

②      分離過程中確保純化柱頂部篩板始終濕潤，以保持分離效果。

③      向純化柱中加入大體積溶液時，可將適配器連接到純化柱，將溶液加入到適配器中。

④      PBS 建議新鮮配制并通過 0.2 μm 濾膜過濾，或使用商業(yè)的無菌 PBS 以防微生物或顆粒污染。PBS使用前必須平衡至室溫，以避免純化柱中出現(xiàn)氣泡影響分離效果。

3.      分離外泌體

(1)     樣品上樣：移除純化柱中的 PBS，在上方加入 1 mL 樣本；如樣本不足 1 mL，可用 PBS 補至 1 mL，混勻后上樣。取下純化柱底部密封帽，待樣本全部進入純化柱后再加 PBS。

注：

①      如樣本體積超過 1 mL，建議用 50 kDa 超濾管將樣本濃縮至 1 mL，濃縮倍數(shù)不超過 20 倍（具體操作見超濾管使用說明書）。

②      對于高粘度樣本（如血漿、血清、高粘度胸腹水等），可取 0.5 mL 樣本用 PBS 稀釋至 1 mL，混勻后上樣。

③      待樣品進入篩板后再加入 PBS，以避免樣品被稀釋影響分離效果。

(2)     外泌體分離：在純化柱下方放置 1.5 mL 離心管，向上方加入 0.5 mL PBS，待下方收集到 0.5 mL 餾分后，繼續(xù)加入 0.5 mL PBS，并更換新的 1.5 mL 離心管收集。按流出順序標記各餾分管編號。

(3)     外泌體收集：收集 4、5、6、7、8 號餾分管以獲得外泌體，其中 5、6、7 號餾分管的外泌體濃度更高?？芍苯訉κ占簻y定外泌體顆粒數(shù)和蛋白濃度。

(4)     外泌體濃縮：測定外泌體顆粒濃度和蛋白濃度后，根據后續(xù)實驗需求，可選擇是否進行濃縮。如需濃縮，建議使用 MWCO 50 kDa 的超濾管，在 4,000g 離心至所需體積即可。

4.      純化柱維護

(1)     收集所有餾分后，將適配器連接至純化柱，從頂部加入至少 2 倍柱體積（20 mL）PBS清洗純化柱，至下方無溶液流出。

(2)     繼續(xù)加入 1.5 倍柱體積（15 mL）20% 乙醇清洗，至下方無溶液流出。

(3)     最后，取下適配器，向純化柱中加入 3 mL 20% 乙醇封閉液，安裝純化柱頂蓋，并在密封帽中填滿 20% 乙醇，蓋到純化柱下端出口，于 4℃直立保存。

注意事項

1． 本產品科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2．  為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3．  新購買或使用后的純化柱，上篩板和白色瓊脂糖微球之間可能會出現(xiàn)一定的空隙，這是儲存和使用過程中凝膠沉降造成的，并不影響純化柱的性能，將上篩板向下推至無空隙即可正常使用。

4．  本試劑盒常用于細胞培養(yǎng)上清、尿液等大體積樣本，也適用于血清、血漿等樣本。其他微量珍貴樣本，請向本公司技術人員咨詢。

5．  純化柱保存在封閉液中，封閉液為 20%乙醇。20%乙醇建議現(xiàn)配現(xiàn)用，同時經 0.2um 濾膜過濾、超聲或真空脫氣，避免造成純化柱出現(xiàn)大量氣泡，影響分離效果。

6．  每次純化柱使用前需要使用無菌并平衡至室溫的 PBS 清洗。PBS建議現(xiàn)配現(xiàn)用，同時經 0.2um 濾膜過濾、超聲或真空脫氣，避免造成純化柱出現(xiàn)大量氣泡，影響分離效果。

7．  純化柱中間不能有氣泡，使用前后需認真檢查，避免影響實驗。

8．  純化柱可以反復利用，但是多次使用會影響效果，建議重復使用不超過5次。

9．  當分離的外泌體進行 NGS 或者其他組學分析時，為避免交叉污染，建議每個樣品使用一支新的純化柱。